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微生物知识点35（第3页）

（3）传代细胞系

原代细胞：

1动物新鲜离体组织块（剪成小块）经胰蛋白酶消化、分散，获得单个细胞，再生长与培养器皿中。

2有人把培养的第1代细胞与传1o代以内细胞统称为原代细胞。

3分离病毒最为敏感，尤其是本动物的原代细胞。

二倍体细胞株：

1将长成的单层原代细胞消化分散成单个细胞继续培养传代，其染色体数与原代细胞一样保持其二倍体型的染色体，称为二倍体细胞。

2如：猪肾细胞系（pk-15）、犬肾细胞系mdck。

3可传至一百代左右

4用于病毒分离和疫苗制备

传代细胞系：

1能在体外持续增殖传代的细胞系，大多数由癌细胞或二倍体细胞突变而来

2方便易得

3用于病毒的分离鉴定和抗病毒药物筛选研究。

常用的细胞培养类型

原代细胞:恒河猴肾细胞、人胚肾、肺等细胞，鸡胚成纤维细胞

二倍体细胞株:猪肾细胞系（pk-15）、恒河猴胚细胞株（hL-8）、犬肾细胞系

传代细胞系:he1a细胞、detroit细胞（胸骨髓细胞系），netgcILk（人结膜c、肠I、肝L与肾k细胞系），Vero（绿猴肾细胞系），bhk-21（幼地鼠肾细胞系）

3。病毒理化特性的测定

（1）病毒核酸型鉴定（单股双股dnaRna正链负链新病毒→逐渐缩小范围）

1卤化核苷酸法→检测为dna还是Rna病毒

2放线菌素d法

3吖啶橙（ao）染色法

4绿豆芽酶：

该酶可降解单核酸，可以测定核酸的股数

（2）耐酸性试验

（3）脂溶性试验

（4）耐热性试验等

4。病毒的血清学和分子生物学鉴定

1病毒分离后，可用已知的抗病毒血清或单克隆抗体，对分离毒株进行血清学鉴定，已确定病毒的种类、血清型及其亚型。

2分子生物学技术鉴定病毒

第二节病毒感染单位的测定

1测定样本中病毒的浓度，即病毒的滴度是病毒学中最重要的技术之一。

2病毒滴度可以通过用稀释的病毒接种细胞培养、鸡胚或实验动物，检测其增殖情况而确定。

3常用于病毒滴度测定的技术有空斑试验、终点稀释法等。

终点稀释法：

（1）用途：

1测定病毒滴度

2确定病毒对动物的毒力或毒价

（2）方法：

将病毒做系列稀释，选4~6个稀释度，接种一定数量的细胞、鸡胚或动物，每个稀释度做3~6个重复

→问tcId5o、Id5o、Ld5o、eLd5o、eId5o

第三节病毒颗粒的检测

1电镜技术常用于直接检测病毒颗粒

2用血凝试验和病毒酶活性测定

电镜技术：

1最直观观察病毒颗粒的方法。但em检测样本中必须有一定量的病毒颗粒，如少于1o7m1则不易检出

2可用磷钨酸盐等重金属盐直接做负染而后观察，适用于观察病毒表面结构。

3器官组织样本则须做薄切片后再做负染观察。可观察细胞内的病毒结构，如冠状病毒、逆转录病毒在组织中出芽的病毒颗粒等。